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Nous proposons le phénotypage cellulaire à haut débit grâce à l'analyse directe par spectrométrie de masse MALDI-TOF appelée plus communément ICM-MS (Intact Cell MALDI-TOF Mass Spectrometry). Cette approche est appliquée soit :

- sur des cellules eucaryotes supérieures, entières et intactes pour caractériser des biomarqueurs de nature peptidique, protéique ou lipidique, sans extraction préalable.

- sur des micro-organismes pour leur identification/authentification. Cette activité s'exerce en partenariat avec le CIRM (Centre International de Ressources Microbiennes).

Les cellules sont directement déposées sur la plaque MALDI puis mélangées à une matrice utilisée pour l’analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Après séchage, le mélange cellules-matrice co-cristallisé est soumis à un faisceau laser pour provoquer l’ionisation des molécules biologiques. Les ions ainsi générés sont triés par l’analyseur temps de vol (TOF) puis enregistrés afin d’obtenir un spectre caractéristique des cellules.

Les profils peptidiques et protéiques sont obtenus dans une gamme de masse allant de 1 à 30 kDa alors que les profils lipidiques sont obtenus dans une gamme de masse allant de 100 à 1500 Da.

L’approche de profiling par ICM-MS présente de nombreux avantages car elle requière très peu de préparation d’échantillons cellulaires et aucune extraction ou séparation préalable des biomolécules. Elle est extrêmement sensible et reproductible car elle permet d’obtenir des profils spectraux de groupes de cellules (biopsies) jusqu’à l’échelle de la cellule unique (ovocytes ou embryons individuels).

©PIXANIM@INRAE

Elle permet de voir des différences de type présence/absence ou de fines variations sur l'abondance des biomolécules.

ICM-MS sur cellules eucaryotes supérieures :

L'ICM-MS est bien connue pour ses applications en phyloprotéomique (identification/taxonomie de micro-organismes) pourtant peu de données sont pour le moment disponibles pour l'analyse de cellules eucaryotes supérieures. Pour palier à la rareté et pauvreté de divers types cellulaires, nous avons développé cette approche de phénotypage cellulaire par « profiling » à partir de l’analyse directe de cellules eucaryotes entières par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight) pour rechercher des marqueurs d’intérêt (peptides, protéines, lipides).

Nous avons adapté l’ICM-MS à l’analyse de différentes cellules eucaryotes supérieures et notamment mammaliennes et procédé à des analyses différentielles à différents états physiologiques ou après un traitement donné. Actuellement, nous appliquons cette méthodologie à l'analyse de spermatozoïdes (aviaires, porcins, ovins, équins, bovins et humains), de cellules folliculaires (cellules de cumulus, cellules de granulosa) bovines, équines et humaines jusqu'à l'échelle de la cellule unique : l’ovocyte bovin, de cellules germinales primordiales (poulet), d'embryons bovins, de cellules sanquines (neutrophiles porcins, bovins et murins, granulocytes hétérophiles aviaires et d'autres types cellulaires (cellules tumorales en culture, cellules végétales entières ou à l’état de protoplastes (Catharensus) ...

Aujourd’hui, l’analyse différentielle quantitative par ICM-MS, à grande échelle avec des analyses statistiques à l’appui, est maintenant devenue une démarche routinière. Il est possible de comparer de multiples conditions (plus d'un millier de spectres) en une seule étude bioinformatique et ainsi de caractériser très rapidement de nombreux marqueurs peptidiques/protéiques ou lipidiques. Après acquisitions spectrales d’un type cellulaire donné, avec plusieurs répliques pour chacune des conditions physiologiques, les spectres sont traités sur un plan informatique (lissage des spectres, alignement, normalisation sur la base du courant d’ions total, détection automatique des espèces moléculaires). Des analyses statistiques robustes sont ensuite réalisées afin de caractériser les biomarqueurs.

En recherche fondamentale, par des analyses différentielles quantitatives (analyses statistiques), le phénotypage cellulaire offre la possibilité d’accéder à de nouvelles informations moléculaires (non abordées par les approches classiques de protéomique). Il permet ainsi de caractériser de nouveaux biomarqueurs permettant une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans une fonction donnée.

De plus, en recherche appliquée, le couplage des phénotypes moléculaires à de la modélisation mathématique (test de corrélation) ou à la méthode de « Machine learning » (Genetic algorithm/Supervised Neural Network) permet de développer et créer des tests moléculaires diagnostics (de classification ou de prédiction) permettant de s’inscrire dans le domaine de l'Intelligence Artificielle et de la biologie prédictive (recherche préclinique humaine et vétérinaire).

L'approche d'ICM-MS ne permet néanmoins que de détecter les biomolécules (visualisation de 150 à 250 pics par spectre). Pour identifier les espèces protéiques endogènes, nous combinons l'ICM-MS et à une approche Top-down basée sur l'utilisation de la spectrométrie de masse à haute résolution. Elle consiste à sélectionner directement à la fragmentation les espèces moléculaires d’intérêt entières et intactes, afin d’obtenir des étiquettes de séquence pour les identifier. Les deux principaux avantages de la stratégie top-down sont l'accès potentiel à la séquence de la protéine complète et la capacité à localiser et à caractériser les modifications post-traductionnelles dans la même analyse. Cependant, cette approche n’est possible qu’après extraction des protéines - µpurification des marqueurs, analyse par MS et MS/MS et interprétation des données par des outils bioinformatiques adaptés.

ICM-MS sur des micro-organismes pour la phyloprotéomique :

En partenariat avec le CIRM (Centre International de Ressources Microbiennes) qui préserve plus de 20 000 souches, nous avons mis en place, depuis 2015, le phénotypage moléculaire de cellules procaryotes dans le but de phénotyper les différentes collections des Centres de Ressources Biologiques (5 CRB en France) du CIRM et de pouvoir proposer une offre de service en phyloprotomique ouverte aux laboratoires publiques ou privés extérieurs. De ce fait, en alliance avec le CIRM, le Pôle propose une solution complète d’outils en spectrométrie de masse (MALDI-TOF RapiFleX, Bruker) et bioinformatique (MALDI Biotyper, Bruker) adaptés pour l’identification/authentification de souches de micro-organismes (bactéries,mycobactéries). Actuellement, nous construisons une banque de données spectrales de référence spécifique, aux domaines de la santé animale et humaine (bactéries pathogènes), de l’agro-alimentaire, et de la santé des plantes (bactéries associées aux plantes).