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Extraction de protéines

La protéomique qualitative et quantitative exige l'utilisation d'échantillons biologiques de qualité. L'extraction de protéines à partir d'organes, de tissus, de cellules isolées ou de liquides physiologiques est réalisée à l'aide de tampons appropriés selon la nature des protéines à étudier (protéines cytosoliques, membranaires, nucléaires…). Les tampons d'extraction à un pH donné, sont composés de mélanges d'agents réducteurs, de détergents, voire de solvants organiques. Ils sont généralement supplémentés d'inhibiteurs de protéases. Les protocoles expérimentaux doivent éviter les contaminations par des acides nucléiques, des lipides et les sels. De façon générale, les protocoles doivent être adaptés pour chaque modèle biologique.

Electrophorèse 2D/1D

L'électrophorèse 2D permet de séparer, en deux temps, les protéines d'un mélange complexe en fonction de deux propriétés distinctes de ces molécules: leur charge et leur masse moléculaire relative. La 1ère dimension consiste à déposer le mélange de protéines sur un gel de polyacrylamide contenant un gradient de pH stable (ampholytes porteurs ou gradient immobilisé). L'isoélectrofocalisation (IEF) consiste à soumettre les protéines à un champ électique.

Les protéines, molécules amphiphiles (qui portent des charges positives et négatives localisées sur les chaînes latérales des acides aminés) sont alors séparées selon leur point isoélectrique (pI). Elles migrent jusqu'à ce que leur charge électrique soit nulle. Différents types de gradients de pH immobilisés permettent de séparer des protéines en 1ère dimension dans les gammes de pH acides ou basiques extrêmes, ou sur l'ensemble de la gamme de pH 3-12. Des gradients de pH étroits et chevauchants décomposent la gamme de pH 4-7 en une seule unité de pH (4-5, 5-6, etc...). Le nombre de protéines détectées est alors multipliée par deux. Les gradients étroits entre pH 7 et 10 restent difficiles d'emploi.
Avant la 2ème dimension, les gels d'IEF sont ré-équilibrés afin d'imprégner le gel de SDS (sodium dodecyl sulfate), détergent dénaturant acide fort, qui va conférer aux protéines une charge négative. Le SDS interagit avec les protéines et donne à chacune un même rapport charge/masse. Une fois le gel d'IEF saturé de SDS, celui-ci est déposé au sommet d'un gel d'acrylamide afin que les molécules soient séparées en fonction de leur masse apparente (kDa). Les tâches protéiques sont ensuite révélées par différentes colorations.

Les protéines hydrophobes telles que les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser. De même, les protéines très basiques, telles que les histones et les protéines ribosomales, sont peu visibles sur un gel 2D après une isoélectrofocalisation.

Certaines classes de protéines rencontrent quelques problèmes analytiques par l'électrophorèse bi-dimensionnelle. Deux étapes critiques ont notamment pu être relevées : la première dimension de séparation (IEF) et le transfert sur la deuxième dimension. Afin de s’affranchir des pertes de matériel à ces étapes, une alternative consiste à simplement effectuer une séparation du mélange protéique d’intérêt par électrophorèse mono-dimensionnelle sur gel d’acrylamide, SDS-PAGE. Dans le cas de mélanges protéiques complexes, une bande de gel colorée peut contenir de nombreuses protéines. L’identification des protéines présentes dans une bande nécessite alors de la nanoLC-MS/MS (cf protéomique par bottom-up).

Chromatographie liquide

La chromatographie est une technique d'analyse permettant la séparation des constituants d'un mélange, basée sur la distribution de ces constituants entre une phase mobile (liquide ou gaz) et une phase stationnaire (solide ou liquide) possédant une large surface de contact. La chromatographie liquide-solide est bien adaptée à la séparation des macromolécules ionisées amphiphiles comme les protéines.